自动荧光显微镜转化过程诱导癌症干细胞研究

利用人工癌症干细胞了解癌症发生和转移的机制，为药物开发奠定基础

Hideyuki Saya博士在庆应义塾大学医学院高级医学研究所基因调控科，以癌症发展和恶性转化的分子机制为主题，研究一线癌症治疗。作为该研究所的第一位教授，Saya博士致力于将先进基础研究中培养的知识和技术应用于临床医学，为癌症和其他难治性疾病的预防、诊断和治疗做出贡献。他主要致力于以分子靶向为核心的生物学方法治疗脑肿瘤和其他癌变的基础研究。

01.通过关注癌症干细胞来了解癌症的机制

癌症是由于肿瘤抑制基因的突变和具有繁殖能力的细胞中致癌基因的激活而导致基因不稳定，导致与生长停滞、细胞死亡和衰老相关的机制出现问题的疾病。

人们通常认为，癌症组织是一群不断增殖的细胞，但最近的研究发现，癌细胞有两种类型。一种叫做癌症干细胞。这些细胞具有自我更新功能，几乎可以永久地产生子代细胞。另一种类型的癌细胞占大多数，最终失去了繁殖能力。也就是说，癌细胞也具有与正常干细胞和祖细胞相似的关系。

癌症干细胞使癌症难以治疗的一个特点是它们的细胞周期缓慢，这降低了这些细胞对抗癌药物和辐射的敏感性。这意味着即使大多数癌细胞死于化疗，癌症干细胞仍然存活。这就导致了无法完全治愈癌症的问题。

庆应义塾大学医学院教授Saya Hideyuki博士利用细胞生物学方法对细胞周期控制机制和细胞粘附控制机制进行了详细分析，并利用动物模型验证了结果。他的研究旨在从分子水平上理解癌症发展、侵袭和转移的机制。

02.探索基于分子靶向概念的治疗方法

从神户大学医学院毕业后，Saya博士希望成为一名治疗脑肿瘤的神经外科临床医生。然而，他面临的现实是，95%的恶性脑瘤患者在2年内死亡。由于目前化疗和手术治疗的局限性，他决定在研究生院进行研究，自己寻找一种治疗方法。然而，他逐渐意识到克服脑瘤有一个巨大的障碍，正如他所说:“虽然我在研究生院获得了博士学位，但我几乎没有发现任何关于治疗的东西。”

1987年，在完成博士学位后，Saya博士开始了他在加州大学旧金山分校脑肿瘤中心的研究。由于UCSF脑肿瘤中心正在研究世界上最先进的癌症治疗方法，他认为他可以了解到最新的技术和治疗方法。在加州大学旧金山分校，Saya博士致力于脑肿瘤的遗传分析，并致力于探索可以导致治疗的目标分子。当时，“分子靶标”的概念仍然是一种进步的方法，并给了Saya博士重要的灵感，导致了他后来的工作。

第二年，Saya博士被任命为德克萨斯大学MD安德森癌症中心神经肿瘤系助理教授。由于该机构是美国最大的癌症治疗机构，Saya博士参与了包括脑肿瘤在内的各种癌症部位的癌症研究。

1994年，在熊本大学医学院开设肿瘤基础研究课程“医学肿瘤学课程”时，Saya博士被邀请成为第一个教授。

在熊本大学(Kumamoto University)，他开始研究不同癌症的细胞周期，包括脑肿瘤。细胞周期是细胞分裂产生的子细胞成长为母细胞，母细胞进一步分裂成新的子细胞的过程。Saya博士关注的是，了解癌细胞周期的机制可以为阻止癌细胞增殖提供见解。因此，他迅速引进了延时观察细胞分裂的方法，并进行了深入的基础研究。他采用这种方法的原因是，他在美国学习期间见过许多案例，“如果你只关注应用研究，而不做任何基础研究，药物发现研究几乎总是会崩溃”

03.细胞药物筛选

Saya博士在前面提到的针对细胞分裂机制的药物发现研究中取得了很大的成果，他在CD44细胞粘附分子方面的研究也很有名。CD44是一种使细胞相互粘附的分子，根据Saya博士的研究，它被认为是肿瘤转移的关键分子。通过控制这个分子，我们可能能够阻止癌症的侵袭和转移。

基于这种处于世界癌症研究前沿的双管齐下的方法，Saya博士的目标是开发一种有效治疗脑肿瘤和其他难治性癌症的分子靶标药物。虽然世界各地在这一领域的研究正在逐步取得进展，但还没有任何研究机构建立了在接近活体的条件下测试药物功效的系统。Saya博士说:“基于培养肿瘤系的体外实验已经表明有效果。然而，研究人体内究竟发生了什么是我们最大的研究挑战。如果我们能越过这堵墙，我们就向药物发现筛选迈出了一大步。”

然而，使用仿生模型进行研究并不容易。简单地说，细胞培养板的环境是二维的，而活体是三维的。最重要的是，后者具有各种混合结构，为癌细胞提供了许多藏身之处。药物的疗效因部位而异。如何克服这种异质性问题是一个大问题。换句话说，研究的重点是如何通过使用细胞的体外方法，重现接近活体的环境。

传统上，在制造一种酶的抑制剂时，通常只用试管中的酶进行筛选。相比之下，Saya博士的实验室正在以细胞为基础测试药物的功效。在这种方法中，细胞在特殊条件下培养，以重现发生在活体中的病理状态。然后这些细胞被用来观察化合物引起的变化。近年来，药物研发的方式发生了巨大变化，Saya博士的努力就是一个例证。Saya博士指出，药物筛选目前正从基于酶的技术转向基于细胞的技术。

体外:试管中的实验环境。相反的概念是“体内”，这意味着一个活的有机体内的环境。

04.成功制造诱导癌症干细胞(iCSC)

目前，Saya博士正在进行的最新研究是利用诱导癌症干细胞进行的细胞分化控制异常分析和癌症药物发现研究，被日本科学技术厅列为进化科学技术核心研究(CREST)。Saya博士利用诱导多能干细胞(iPS)生产技术，对正常小鼠细胞进行了基因改造，成功地将其诱导成具有自我更新、分化和致瘤能力的癌症干细胞(iCSC:诱导癌症干细胞)。

Saya博士计划使用不同的iCSCs探索肿瘤形成的机制，同时旨在筛选可以控制肿瘤发生的化合物和抗体。目前，他的研究对象是小鼠，但它的目标是最终从人类正常类型的细胞中产生iCSCs，作为开发癌症治疗药物的靶点。

在以癌症干细胞理论为基础的最新研究中，正在研究分别针对子代癌细胞和癌症干细胞使用药物的方案。这是一种治疗方法，首先用治疗药物杀死子代，然后用另一种药物靶向癌症干细胞(之前治疗药物对其不起作用)。这种方法被认为有机会显著提高治疗效果。

05.荧光显微镜不需要暗室彻底改变了研究

随着目前的趋势越来越倾向于关注基于细胞的癌症治疗研究，Saya博士提到，图像观察越来越受到重视，显微镜的作用也变得越来越重要。他说:“三维观察对于彻底检查癌细胞的变化至关重要。此外，除了观察癌细胞外，对癌细胞进行计数也是验证异质性的必要条件。支持快速观察和测量的显微镜很受欢迎。”

从他学生时代在细胞研究方面的丰富经验来看，Saya博士说荧光显微镜一直是而且是必不可少的仪器。他回忆起过去的困难:“每天我都会把自己锁在暗房里3个多小时进行观察。我曾经用袖珍灯照着我的手，当我给细胞画草图的时候。然而，这项工作效率很低，更不用说它对我的眼睛造成了压力。”

因此，当他在熊本大学学习期间的一次演示中第一次看到KEYENCE的BZ系列荧光显微镜时，他感到非常惊讶。“能够通过监视器而不是目镜进行观察是划时代的。我们决定安装BZ系列，因为有很多学生要求使用它。”

在安装了BZ系列之后，我们很快就看到了效果。由于BZ系列在亮场显微镜中的可用性，Saya反映了观察变得更容易。“另一个很大的优势是，我可以和一群学生一边看着显示器，一边讲解重点和指导实验。这在使用仅配备目镜的显微镜时是不可想象的。”

在目前的药物发现中，化合物通常被单独筛选出来，但有效的筛选仍然至关重要，因为候选化合物的数量可能在数千到数万个之间。公平地说，捕捉图像和快速观察的能力取决于显微镜的质量。

Saya博士认为信息共享在教育环境中很重要，他还提到他故意让细胞图像清晰地显示在显示器屏幕上。根据Saya博士的说法，通过确保学生在实验室中看到这些图像，学生们会变得更感兴趣，并意识到拍摄清晰图像的重要性，从而有动力这样做。Saya博士说:“通过图像分享研究成果可以提高整个实验室的水平。”

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06.BZ系列有助于提高研究效率

Saya博士在选择研究仪器时的一个重要标准是它是否有助于加快研究速度。与此同时，他也尊重实验室里有多少研究人员能够或想要使用它。Saya博士说:“从这个意义上说，实验室里几乎每个人都在使用BZ系列。我还高度评价它的可靠运行——没有机械故障——尽管它的利用率很高。”

对于使用小鼠进行的基于细胞的癌症侵袭和转移观察，需要检查一个器官的连续切片。每个器官都需要20到30条切片，他说，这个数字是传统眼科显微镜无法在短时间内完成的。然而，通过使用BZ系列，所有图像捕捉可以在大约1小时内完成。

Saya博士还高度重视图像拼接功能，该功能可以在广域成像后快速无缝地连接图像。Saya博士说:“当我在学术会议上发表照片时，我经常会被与会研究人员问到我是如何拍摄这些照片的。”

详细检查癌细胞增殖情况需要在仿生环境中进行三维观察，他提到xy - z轴分期在垂直轴观察中很有用。

Saya博士还补充说，他经常使用细胞计数函数来测量在给定密度下包含多少癌细胞。在这个观察需要量化的时代，这一功能变得越来越重要。

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07.具有雾霾消减功能的清晰图像

合作研究员Takatsugu Ishimoto博士也经常在Saya实验室使用BZ系列。目前，他正在从事胃癌发展的研究。近年来，幽门螺杆菌的参与已被确定为胃癌的病因之一，但其体内机制尚未完全阐明。通过使用转基因小鼠进行研究，石本博士试图在分子水平上发现胃癌发生的机制。

Ishimoto博士使用BZ系列来观察整个小鼠胃和小鼠胃的切片。
“传统上，使用荧光显微镜观察组织切片不是一件容易做到的事情——它远比现在更不容易接近或接近。首先，如果你想观察一些东西，你需要准备有标本的载玻片，然后带着这些载玻片跑到另一栋楼的暗房。这是一个主要的麻烦。在这个问题上，BZ系列非常有用，因为它可以放在实验室里，在我们需要的任何时候都可以使用。”

石本博士说，当有很多实验要进行时，他几乎每天都使用BZ系列。
“最吸引人的是清晰的图像。我发现消除荧光模糊的雾霾减少功能非常方便。它可以清楚地显示目标细胞的发育，并产生令人信服的图像。”

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08.BZ系列用于捕获一篇论文的所有图像

石本博士说，BZ系列也有助于简化研究。“我使用细胞计数功能来计数目标细胞。它非常有用，因为它计算得又快又准确。以前，我们常常拿着计数设备手动计数每个细胞，但这需要大约半天的时间。使用细胞计数功能，可以在几秒钟内完成相同的计数。”

石本博士还提到，该软件易于操作，任何人都可以直观地使用它。

实验室还有一台共聚焦显微镜，但自从安装了BZ系列之后就很少使用了。Ishimoto博士解释说:“由于共聚焦显微镜是实验室成员共享的，我们需要先预约，这意味着我们不能在任何时候立即使用它。但是，BZ系列就在手边，可以随时使用。此外，它非常方便，因为我们只需要一台仪器就可以完成所有必要的研究任务，如观察、图像捕获和细胞计数，”强调了使用BZ系列的一些好处。

石本博士目前正在完成他的论文，准备在一次会议上发表。用于演示的图像都是用BZ系列拍摄的。

“胃癌和其他胃肠癌症的发病机制尚未完全了解。另一方面，乳腺癌和白血病的研究也取得了进展。就我个人而言，我希望通过阐明消化系统癌症的发展机制，为癌症治疗做出贡献。”

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09.癌症治疗的实质性改变的可能性

Saya博士使用iCSC进行的基于细胞的研究有可能成为癌症药物发现筛选的标准方法。除癌症外，它也被认为是一种很有前途的治疗遗传疾病和代谢性疾病的方法。

Saya博士的最高愿望是发现脑瘤和其他难治性癌症的治疗方法。他希望提供一个基础，使医生能够在世界各地提供相同的药物治疗。“我的梦想是用口服药物治愈脑瘤，”Saya博士说。

未来使用iCSC的前沿研究的进展将确定癌症的发展机制，并彻底改变癌症治疗的概念。癌症目前是导致死亡的第一大原因，也许有一天它将不再是绝症。

(截至2009年3月)

<常识>诱导癌干细胞(iCSC)

诱导性癌症干细胞是利用诱导多能性干细胞生产技术人工制造的癌症干细胞。通过对小鼠的造血细胞和骨髓基质细胞进行基因工程，有可能制造出诱发恶性肿瘤的诱导癌症干细胞(iCSC)。iCSC将为癌症治疗药物的研发做出重大贡献。iCSC也可能有助于理解癌症发展的潜在机制，这是目前iPS细胞临床应用中尚未解决的问题。