荧光显微镜
阵容
BZ-X系列是一种一体机荧光显微镜，配备先进的观测能力，全电动控制系统的即时目标采集，先进的成像和分析功能。BZ-X倒置荧光显微镜有一个内置的暗室和一个~ 1' x 2'的安装区域，可以设置在任何位置，以获得最佳的测试效率。高灵敏度，冷却CCD相机可以在单色和彩色成像之间切换，并支持荧光，亮场和相位对比成像。大型电动舞台可以快速移动到所需的观测位置，而高速自动对焦和自动捕获条件允许任何用户轻松捕捉出版质量的图像。此外，BZ-X系列一体机显微镜能够进行三维分析，运动分析和时间序列量化。
荧光显微镜是一种利用荧光观察样品的光学显微镜。荧光显微镜用特定波长的光照亮目标，使目标吸收光并发射更长的波长。这会使目标在黑暗的视野中发光。
与传统显微镜不同的是，荧光显微镜使用高灵敏度的探测器只测量从目标发出的光，实现高分辨率的观察和成像。
荧光显微镜的好处
荧光显微镜将光发射到用荧光染料染色的细胞上，使其能够比使用反射光的传统显微镜更清楚地看到细胞特征。荧光显微镜也是高度敏感的，可以检测亮度和波长的差异。这样就能观察到标准白光光学显微镜无法观察到的细节。
光学显微镜的分辨率根据用于观察的光的波长而变化，并受物镜孔径的限制。观测分辨率也受到物镜可见光的最短波长(约200 nm)的限制。
然而，在荧光显微镜下，细胞被荧光染料染色，以便在更高的分辨率和细胞结构之间更大的对比下观察。通过使用不同的染料和不同光谱的带通滤波器，也可以获得多种荧光染料的观测图像。
大多数共聚焦激光显微镜的波长范围很窄，可以在给定的时间被激发。如果减小针孔直径以增加分辨率，则直径越小就需要更高的激光功率。这可能会导致荧光染料褪色和对活细胞的损伤。相反，荧光显微镜可以通过结合白光光源和激发滤光片来激发广泛的细胞。使用高灵敏度的图像接收元件可以在对样品损伤最小的情况下进行荧光观察，使观察活细胞更容易。
大多数共聚焦激光显微镜通过使用单波长激光和小针孔直径来最小化激发区域来实现高分辨率。而当激发波长变窄，针孔直径减小时，光强减小，噪声增大。增加激光功率和降低扫描速度可以解决这个问题，但这增加了对活细胞的损伤风险。
现代荧光显微镜使用波长从紫外线到近红外的白光光源，并为荧光试剂使用适当的激发滤光片，可以实现激发荧光的无损耗成像。高灵敏度的图像接收元件允许使用较弱的光强度，并降低样品损坏的风险。这使得对活细胞的高清观察变得容易延时和实时成像。
现代荧光显微镜使用电子投影元件进行结构化照明，使标本能够高速扫描。BZ-X系列配备了使用白光光源而不是激光的光学分割模块，最大限度地减少了损伤。这允许在宽波长范围内的高精度光学切片成像，没有荧光模糊。
对于较厚的标本，由于荧光模糊，传统的荧光成像很难获得清晰的图像。荧光模糊是由失焦的z方向散射光与聚焦表面的清晰信号混合而成的。
在现代荧光显微镜中，激发光被构造成条纹并投射到标本上。虽然条纹清晰地投射在聚焦的表面上，但它们不清晰地投射在非聚焦的表面上，不能被观察到，从而减少了噪声。然后，在移动模式的同时扫描标本，自动获得多个图像。图案的移动使荧光模糊的区域与样品的其余部分精确分离。这个过程能够捕获清晰的切片图像，只显示来自聚焦表面的信号。
有两种构造激发光的方法:使用物理网格或使用电子投影元件。除了根据放大倍率自动优化图案宽度外，使用电子投影元件可以将图案转换为针孔形状，以实现更高分辨率的成像。
荧光显微镜案例研究
癌症研究，细胞生物学:外泌体的局部观察
外泌体的直径为30 ~ 150nm，因此很难用光学显微镜观察到。电子显微镜通常不用于测量物理性质，因为电子束会改变细胞。设备也很大，所以配备电子显微镜的设备数量是有限的。
对于使用BZ-X系列的外泌体观察，使用荧光染料可以使外泌体可视化，并且可以观察提取的外泌体(RNA货物)和外泌体膜中所含的RNA。这种观察可以监测时间依赖性的外泌体定位变化和外泌体被带入细胞(通过外泌体进行细胞间通信的过程)。
BZ-X系列作为一种新的技术，使外泌体的分析具有更高的准确性，正在受到关注。
临床医学:CD68(巨噬细胞)肾小球占用率自动分析
CD68(巨噬细胞)渗透到肾小球是所有进展性肾脏疾病的普遍现象。CD68的观察包括HE染色，然后捕获肾活检的鸟瞰图。用普通显微镜聚焦较厚的样品是很困难的，但是BZ-X系列z-堆栈图像捕获使观察与整个图像聚焦。此外，高速图像拼接能够捕获高分辨率的大图像进行分析。肾小球——由毛细血管组成的微观小球——控制着肾脏的过滤功能，单个肾脏中约有100万个肾小球。CD68渗透到这些肾小球导致肾脏组织纤维化和进行性肾脏疾病的现象。BZ-X系列提供了治疗这种疾病的重大进展，使其成为流行的观察系统。
材料化学:纤维分散在复合材料中的可视化
由混合有机和无机材料制成的复合材料，如果在制造过程中没有均匀地混合，就可能没有预期的特性。有机和无机物质的混合通常可以用光学显微镜或电子显微镜来确认。然而，如果有机和无机材料是相同的颜色，视觉化的分散，只有有机材料可能是困难的。一般来说，有机材料发光，而无机材料不发光。荧光观察利用这一特性，仅能使有机物质可视化。
BZ-X系列捕获连续荧光和光学(亮场)图像瞬间，容易产生叠加图像。这提供了一个清晰的理解有机物质的分散，同时观察整个形状。利用定量分析软件可以将发光部分转换为二值图像。这种转换进一步允许基于物质数量、面积和其他数值参数进行定量评估。BZ-X系列可以提供宽视场的图像，无论放大，从而实现准确的评价和判断。
井板定量分析
大型机动舞台确保支持各种各样的目标。与先进的导航功能相配合，可以快速找到所需的区域，工作台使研究人员能够进行快速的广域观察，在此过程中他们永远不会迷失目标。用户指定点的捕获条件也可以立即应用到井内的所有视场。这使得所有井都可以使用相同的捕获条件进行成像。
统一的捕获条件可实现高再现性，所有设置都可以轻松配置，消除了用户从开始到结束监视显微镜的需要。
除了减少测量时间和在条件不变的情况下实现精确分析外，利用一体化荧光显微镜的高清图像的高密度测量数据提供了前所未有的清晰观察。
捕捉活细胞和组织的变化
有了BZ-X，就有可能在指定的间隔捕获扩展的光场延时图像、荧光图像和相位对比图像。默认情况下，延时观察需要大量的时间投资和失败的观察可能性增加，主要是由于细胞损坏，细胞漂移出焦点，细胞离开视野。
BZ-X配备了各种功能，以解决执行延时成像时遇到的常见问题。因为BZ-X系列使用白光而不是激光，细胞损伤是最小的，即使在很长一段时间。此外，BZ-X具有先进的成像功能，减少了样品的曝光时间。BZ-X还配备了跟踪功能，以确保细胞保持在焦点和视野内，即使标本改变了位置或形状。由于先进的跟踪和成像算法，BZ-X显微镜是执行延时成像的理想解决方案。
适用于广泛的应用
冷却CCD单色相机提供了清晰的共焦图像，结合了高灵敏度和低噪声。
这使得即使在低激发光下也能实现清晰的荧光成像，最大限度地减少光漂白和对光毒性敏感细胞的损伤。该相机还能够在近红外范围内对Cy7等染料成像，以便观察位于组织深层的细胞层。此外，它使用金属卤化物灯作为荧光光源，其波长范围从紫外到红外。这使得只需改变过滤器就可以支持一系列荧光颜料。BZ-X系列中独特的光学切片技术使用电子投影元件进行结构化照明，提供令人印象深刻的清晰图像。单点抓取高清图像是可能的，没有荧光模糊。
通过对共焦点信息的准确检测，即使是较厚的标本也能获得清晰的图像。这一特性可以捕获各种标本，如动物细胞、植物细胞和培养的组织。光学切片也提供高精度的截面图像，没有荧光从其他焦平面模糊。清晰的z栈可以转换成逼真的3D渲染图，从而实现精确的定位分析。
关于荧光显微镜的常见问题
虽然这两种设备都使用荧光蛋白或标本本身发出的荧光进行观察，但荧光显微镜使用白光源，而共聚焦显微镜使用激光。下面列出了这两种显微镜的其他主要区别。
荧光显微镜:
•光源包括汞灯(超高压汞灯、金属卤化物灯等)和led。
•将光投射到目标的整个表面，并使用图像接收元件捕获激发的荧光。
•来自焦平面以外的光也被捕获。现代荧光显微镜使用结构化照明来消除模糊。
•白光光源的波长范围很广，从紫外线到近红外，用于在单一光源下捕获各种波长的荧光(需要使用适当的滤光器)。
共焦显微镜:
•使用激光作为光源。
•激光被照射成一个点的形状，并扫描过目标表面，使用光电倍增器接收激发的荧光，以创建观测图像。
•通过在与焦平面共轭的位置放置一个针孔，可以消除来自焦平面以外的模糊，确保只捕捉焦平面。
•一般来说，单波长激发光由单个激光管发射。需要额外的激光管来检测多种荧光。
荧光显微镜主要用于观察、成像和分析生物样本，如组织和细胞。它们通常用于癌症、细胞生物学、制药和临床医学的研究和研究。
BZ-X系列有一个内置的暗室和安装尺寸~ 1' x 2'，因此高对比度荧光成像是可能的任何地方。
尽管BZ-X系列体积紧凑，但包括一个大型电动工作台，可以与井板一起使用，用于高效观察多个样品。最多可安装六个物镜，CCD相机可以在彩色和单色模式之间切换。几乎所有的操作都可以在PC上完成，从切换物镜和滤镜到调整焦距。低光漂白模式和高速自动对焦功能允许任何人，即使是初学者，捕捉清楚的图像。
该系统还提供了广泛的扩展功能，以支持各种标本，包括光学切片，自动图像拼接，和细胞术。BZ-X系列是一种多功能显微镜，能够用于各种各样的应用。
荧光显微镜由一个相机(CCD、CMOS等)组成，它充当探测器、滤光片、光源和分束器。该滤波器由励磁滤波器和发射滤波器组成。在传统的荧光显微镜中，透射方法涉及到一个暗场聚光镜，它从光学观察路径上完全切断了照射样品的激发光。然而，近年来，反射短波和发射长波的二色镜的发展，以及由具有低自身荧光的玻璃制成的物镜，导致了外显照明方法的主流使用。下一节将解释epifluorescence显微镜的组成部分。
CCD相机(探测器)
利用CCD相机对发射的光进行荧光观察。摄像机与计算机相连，以显示捕捉到的图像。
光源
水银或氙气灯或led灯被用作光源。
激发滤
激发滤光片只允许特定波长的光通过，同时屏蔽所有其他波长的光。
二色镜(分束器)
二色镜将激发光与发射光分开。与普通的镜子不同，这种镜子只反射特定波长的光，过滤掉所有其他的光。由于激发光从样品反射，只有样品发出的荧光被传输到CCD相机。
发射滤光片
发射滤光片阻断了除样品发出的光外的所有波长的光。通过这种方式，样品发出的荧光被所有其他光(包括散射光)过滤掉。
A:激发滤光片，B: CCD相机(探测器)，C:发射滤光片，D:二色镜(分束器)，E:物镜，F:样品，G:光源
荧光显微镜的过滤器
角色的过滤器
激发滤光片、二色镜和发射滤光片都装在显微镜的一个镜面单元或“立方体”中。这种镜子单元是设计来匹配特定荧光材料的光谱*。然而，有些镜像单元不包括过滤器。在这种显微镜中，滤光片被放置在转塔上。该转塔用于将激发波长和发射波长结合到最佳状态。
*光谱:由分光计分辨的光产生的不同波长的光强度分布阵列。
选择一个过滤器
过滤器的选择取决于观察是否涉及一种或多种荧光染料。例如，对于只观察一种荧光染料，为该染料选择适当的激发滤波器和发射滤波器。对于观察两种或两种以上的荧光染料，激发和发射过滤器组合将根据特定的染料而变化。这是由于特定荧光染料之间的特定光谱变化，因此了解荧光染料的光谱对选择滤光片是必不可少的。
确定光谱
在选择滤光片时，必须首先确定每种荧光染料的激发光谱和发射光谱。当使用两种荧光染料时，应对其中一种染料使用透射范围较窄的染料分离过滤器，以消除另一种染料的激发。否则，如果一个滤波器的透射范围包括长波长区域，则也会观察到另一个滤波器的荧光。
用于其他荧光染料的过滤器也应与所需的光谱相匹配，以便进行观察。采用适用于每种荧光染料的窄传输范围的滤波器，因此可以只观察目标信号。
选择励磁滤波器
根据光波长范围的宽度，有宽带和窄带滤波器可供选择。所选的滤光片应尽可能特定于荧光物质的激发波长。特别是当使用水银灯光源时，有效的激发要求水银灯的发射线与激发波长相结合。一般来说，使用与被观察荧光材料的激发波长不同的波长波段的强光会增加背景光，从而获得更明亮的图像。然而，因为这可能会不必要地损坏样品，一般首选窄带滤波器。
选择发射滤波器
发射滤光片的选择取决于光源。当使用白光光源时，由于光带宽，只需要提取激发所需的波长，因此通常使用光学滤波器。
光学滤光片有多种类型，从简单的彩色玻璃滤光片到只透射特定波长光的干涉滤光片。为了只提取某一波长的光，通常使用只传输狭窄波长范围的旁路滤波器。如果只观察一种荧光染料，则使用长通过滤器或短通过滤器。
长通和短通过滤器
在观察单一荧光染料时使用长通和短通滤波器。长通滤波器通过阻挡激发光和允许所有其他光通过来减少背景噪声。
然而，短通滤波器只允许小于特定波长的波长通过。这些滤波器通常用于单一染料的观察，因为它们最大限度地提高了信号检测。
带通滤波器
当样品中使用多种荧光染料时，就使用带通滤波器。每种染料发出的光是分开的，因此探测器只接收到样品发出的荧光。
总结
荧光镜单元可以根据需要购买滤光片和二色镜单独组装，以匹配光源。这允许用户为所使用的特定荧光染料创建理想的镜像单元组合。
综上所述，可靠的荧光成像需要适当选择滤光片。采用一体化荧光显微镜，滤光体、光源和透镜集成在一起，易于调整，安装轻松，操作简化，即使不熟悉操作显微镜的人也可以进行可靠的观察。
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