培养细胞转染效率的测定

什么是转染?

转染是将核酸引入动物细胞，使细胞引入特定基因来表达感兴趣的蛋白质的过程。通过转染引入的核酸称为外源核酸。基因可以在没有病毒的情况下被引入目标细胞，这与转导不同，转导需要病毒来转移DNA。
核酸可以被暂时引入以表达蛋白质，或者与宿主细胞的基因组一起复制。暂时引入核酸称为瞬时转染，同时进行核酸复制的转染称为稳定转染。因此，转染可用于增强或抑制转染细胞中特定基因的表达，或生成重组蛋白。

转染的原则

细胞膜是由含有蛋白质的脂质双分子层组成的，它带有负电荷，可以阻止带负电荷的大核酸(如DNA和RNA)通过。为了使转染成为可能，核酸必须以其他方式通过细胞膜。其他允许核酸通过细胞膜的方法包括化学、生物和物理方法，每种方法的原理不同。本节以将基因导入细胞为例解释每种方法。

提高转染效率

转染效率是靶细胞对核酸的吸收效率。本节介绍了提高转染效率需要考虑的各种因素。

细胞活力和传代

转染前细胞活力应至少为90%。传代——即细胞从培养物转移到新培养基的过程，也应在转染后24小时内进行。另外，要注意过度传代会对转染效率产生不利影响，因此应仔细记录传代数。

细胞培养和试剂

con流畅性是指转染细胞的理想增殖状态，根据检测目的、方法、细胞类型等的不同而不同。如果汇合度过高，则可能导致核酸吸收不足，或降低转基因表达。如果汇合度过低，细胞间接触可能不会发生，从而防止增殖。
培养用于转染的细胞的最佳培养基取决于细胞、试剂和细胞类型血清。例如，在将DNA导入干细胞时，使用的试剂可以将核酸导入胚胎干细胞(ES细胞)、诱导多能干细胞(iPS细胞)、人成体干细胞等高效低毒的细胞。将RNA导入干细胞时，使用能够导入siRNA(小干扰RNA)、mRNA(信使RNA)和dsRNA(双链RNA)，同时保护干细胞不降解的试剂。

转染方法选择

转染方法包括化学、生物和物理转染。化学和物理转染通常用于培养细胞的靶向转染。生物转染对转染培养细胞和动物细胞均有效。然而，根据细胞类型和条件的不同，化学转染可能导致转染效率或化学毒性的变化，对某些细胞进行选择性转染可能比较困难。同时，物理转染需要特殊的仪器和设备，核酸很容易被破坏。生物转染也有污染的风险，当将治疗基因引入细胞染色体时插入突变，以及基于免疫的失活。
由于每种方法都有其缺点，因此对于转染细胞与靶细胞的特异性结合，选择转染效率高、重复性高的转染方法至关重要。

其他因素

转染效率也因使用血清或抗生素而异。例如，当引入DNA时，在含有血清的培养基中培养细胞可以提高效率。在含有抗生素的培养基中进行瞬时转染也能提高转染效率。
然而，抗生素也会引起细胞毒性，对细胞产生不利影响，降低转染效率。此外，DNA和RNA载体都可以用于瞬时转染，但只有DNA载体可以用于稳定转染。

测量转染效率

测量转染效率的一种一般方法是使用荧光显微镜。转染效率的测量方法是计算观察到的细胞总数和表达荧光的细胞数量，并对这些值进行评分。

转染效率测量的挑战

传统的荧光显微镜存在各种各样的问题，通常难以使用。
首先，观察荧光需要将标本带到暗室进行实验，可操作性极差。准确提取细胞的轮廓也很困难，阻碍了细胞数量的准确计数。
此外，为了计数和分析细胞数量，需要与荧光显微镜系统分离的软件，导致许多客户注意到难以进行顺利分析。

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物镜:CFI Plan Fluor DL 10x

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