荧光成像:失败的原因和成功的秘诀
荧光显微镜是由各种各样的组件组成的，了解每个组件的功能可能需要很多时间。即使没有详细的荧光显微镜机理的知识，仍然可以获得准确的实验数据。本节通过荧光成像中典型故障的例子，总结了在短时间内有效捕获图像的要点。
荧光成像技术
荧光成像通过使用荧光标记试剂或荧光抗体进行标记，可以可视化无色透明的细胞器官和某些蛋白质，而这些蛋白质未经事先处理就无法观察到。这种技术允许观察和分析细胞和蛋白质的形状、结构和行为。
荧光试剂和荧光抗体具有一种特性，即当用特定波长的光(激发光)照射时，它们会发光，这可以用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察。
荧光成像可以实时观察活细胞，可以在分子水平和细胞水平进行各种实验。同时，这些实验结果的分析和评价质量受到荧光显微镜所选择的相机、镜头和光源的影响。
荧光成像常见故障1:图像不聚焦。
对于显微镜来说，聚焦是最基本也是最重要的因素。捕捉有焦点的图像可以对实验进行准确的评价，而图像的质量影响论文的接受。本节首先解释捕捉焦点清晰图像的要点。
第一点:检查使用的镜头是否合适。
对于显微镜观察，你需要知道透镜特性是否符合观察目的。数值孔径(NA)在荧光观测中尤为重要。NA越大，分辨率越高，图像越亮。一般来说，较大的NA能提供更高分辨率和更多细节的图像。与此同时，景深(DOF)变得更浅，缩小了目标的聚焦范围。除了NA和DOF，镜头的亮度和观察距离也需要考虑。这些特征具有下表所示的相关性。
一般镜头特性
| 决议 | NA | 观察距离 | 景深 | 亮度 |
|---|---|---|---|---|
| 高 | 大 | 短 | 浅 | 明亮的 |
| 低 | 小 | 长 | 深 | 黑暗 |
透镜有各自的特点*3.．除了以上这些，一些镜头需要盖玻璃校正*1或校正环调节*2另一些则有专门为特定观测方法设计的光学系统。使用与你的观察方法相匹配的镜头是很重要的。
*1盖玻璃修正:
盖玻璃校正镜片设置有盖玻璃校正值。盖玻璃通常是0.17毫米(0.007")厚，但使用1.2毫米(0.047")厚的塑料盘子的镜头和一个0毫米厚的无盖玻璃。
*2校正环调节:
一些高倍倍率镜头的表壳上有一个校正环(看起来像一个表盘)。当这个环根据盖玻璃厚度调整时，分辨率成倍增加。一定要检查校正环状态。
*3镜头特性:
根据观察的类型，可能需要使用特定的透镜和专门为特定方法设计的光学系统。还有其他各种特性，如相位对比度、差分干涉对比度(DIC)、偏振、荧光和油浸。检查镜头类型。
要点二:调整镜头从低倍率到高倍率。
要点3:为了聚焦图像，将镜头靠近样本，然后将它移离样本。
荧光成像常见故障2:荧光信号暗或对比度差。
在荧光成像中，重要的是获取显示目标荧光分子或荧光蛋白清晰信号的图像。为了获得这些图像，各种设备的组合很重要，如相机、滤光片和光源。不恰当的组合使荧光信号变暗或对比度差，导致图像难以观察。本节解释为了获得清晰的图像需要检查的要点。
第一点:使用适合观察的相机。
相机有很多种类型，但在这里我们将讨论CCD相机的特点，这是最常用的与荧光显微镜。
在荧光观测中，具有较高的信噪比(S/N)是很重要的。下表显示冷却CCD单色相机是最合适的。
| 颜色 | 单色 | |
|---|---|---|
| 型无冷 |
|
|
| 冷却 |
|
|
*1可见光:
一般来说，这是指波长大约在400纳米到700纳米之间的光。彩色相机以与人眼相同的方式表达图像，因此700纳米及以上的波长被截断。因此，不可能观察到这些波长的光。
*2暗电流和冷却:
即使CCD相机没有暴露在任何光线下，暗电流信号也会产生，并在图像中产生不必要的噪声。CCD曝光时间越长，温度越高，噪声越大。这种噪音可以通过冷却相机来减少。
要点二:使用亮度调节功能。
有各种亮度调节功能，但在通用相机设置的关键项目是如下三个。了解它们的特性是很重要的，以便根据情况有效地使用这些不同的设置。
- 曝光时间
- 这是快门打开的时间。你设置的时间越长，图像就会变得越亮，因为在曝光过程中会存储信号，但这也会增加存储的暗电流造成的噪声量。
- 获得
- 这个功能电放大应用到CCD元件的电信号。然而，当输入信号被放大时，噪声也被放大了。增益值不影响分辨率。
- 装箱
- 这个函数虚拟地将相邻像素视为单个像素，以增加每单位像素的接收信号量。图像分辨率下降是因为像素数实际上减少了，但噪声没有增加。
要点三:荧光滤镜与试剂的匹配。
如果滤波器的透射比低，即使是明亮的荧光信号也不会被观察到。重要的是要使用具有尽可能高的透射率的滤波器。
荧光滤光片由三个部分组成:激发滤光片、吸收滤光片和二色镜。检查激发过滤器的激发光谱与试剂是否重叠，吸收过滤器的荧光光谱与试剂是否重叠。例如，如果470/40写在一个滤波器上，这意味着470 nm±20 nm波段被覆盖。如果仅用数值很难理解匹配，可以查看试剂和过滤器的光谱数据，看看是否匹配。您可以从其制造商的网站或类似来源查看试剂和过滤器的光谱数据。
要点4:选择镜头。
如前所述，如果荧光信号弱或对比度差，可以通过更换NA高的透镜来进行明亮的观察。NA越大，荧光信号越亮。NA随着放大率的增加而增加。如果信噪比没有像你想的那样增加，这个问题可以通过增加镜头放大倍率来解决。
要点5:选择光源。
根据你的光源，你可能不会产生你想要观察的波长。使用适合观察的光源是很重要的。检查你正在使用的光源并确定它的特性。
水银灯和金属卤化物灯的波长范围从短到长。另一方面，激光和LED光源都只产生特定的波长，因此与其他光源结合使用。如果信号不太亮，检查试剂波长和光源的光谱数据。
荧光成像常见故障3:发生光漂白，细胞变弱。
光漂白和细胞弱化最常见的原因是激发光引起的损伤。当细胞暴露在强激发光下哪怕是片刻，光漂白就会加速，导致细胞因光毒性而变弱。为了防止这种情况，第一步是降低激发光的强度。即使强度很低，长时间暴露在激发光下也会持续减弱荧光信号，引起光漂白，并逐渐损伤细胞，使其失去活性。除了降低强度外，缩短细胞暴露在激发光下的时间也很重要。
要点1:降低激发光的强度。
降低激发光的强度使荧光信号的强度变暗，所以你必须增加相机的增益或延长曝光时间。如果你做了其中任何一件事，就会产生相应数量的噪音，这可能会导致信噪比降低。
为了捕捉高信噪比的图像，同时减少光漂白和损坏，使用尽可能高灵敏度的相机是很重要的。
要点二:减少激发光的曝光时间。
为了减少激发光的曝光时间，你只需减少操作时间。尽量减少所有必要步骤的操作时间是很重要的，例如聚焦图像的时间、搜索信号的时间和设置曝光时间的时间。
当你使用需要手动打开和关闭激发光快门的显微镜时，你可能会忘记关闭快门，使标本持续暴露在激发光下，导致光漂白。当你完成拍摄或暂停观察时，经常关闭快门也是很重要的。
