活细胞成像:成功的秘诀
科研人员的数量进行活细胞成像(也称为延时成像)近年来有所增加。这种成像的优点是,它可以观察在没有固定靶细胞存在,这样的变化可以观察到细胞自身的结构。另一方面,许多研究人员知道相当多的观察导致失败由于这种成像有困难的目标比正常观察活细胞,需要更多的时间。
本节介绍了三种最常见故障的建议对策,以帮助改善成功率活细胞成像。
常见的活细胞成像失败示例1:细胞受损。
过程中或之后活细胞成像实验中,你会发现细胞固定,死亡,或其他损坏。这些问题有几个原因:
原因1:光毒性细胞受损。
在荧光观察,激发光的波长越短,强烈的光线越多,细胞受损越大。这就是所谓的光毒性*1,这不仅会削弱或杀死细胞,但也以意想不到的方式影响他们。
对策
- 使用相机尽可能高的灵敏度。
- 使用获得*2一起装箱*3和其他功能配置设置,甚至弱荧光可以被探测到。
- 减少尽可能的激发光的强度。
- 当设置图像捕捉,尽可能少的激发光的细胞。
- 捕获尽可能少的图像。
- 关掉光激发时捕捉图像。
- * 1光毒性:这通常是指损害由光照引起的,但它也指的是一个细胞进行荧光的现象产生活性氧,进而损害周围的细胞。
- * 2获得:这是一个函数,电放大信号接收的相机。越高程度的放大增益越高,越亮显示。没有改变像素的数量,但噪声发生。
- * 3装箱:这是一个函数,它几乎一起周围的像素单位像素放大接收到的光信号。低噪音发生增益时相比增加,但是像素的数量却降低了。
原因2:适当的环境不是维护。
大多数的细胞喜欢一个模拟的环境标准的生理条件。人类细胞,例如,经常要求温度37°C,湿度5%的二氧化碳浓度,保持95%或更高的室或孵化器用于种植。如果这种环境不稳定的方式提供,细胞会削弱,它将很难获得准确的数据。
对策
- 使用室或孵化器能够稳定供应一个适当的环境(温度、二氧化碳浓度和湿度)。
- 在季节室温波动较大时,使用空调和其他设备稳定室温。
- 确保空气吹空调和其他设备不直接攻击的示例。
- 当使用多井的边缘板时,选择一个板,防止水分蒸发。
原因3:样品内的污染
一些细胞可能受到细菌和污染贴在容器中。此外,支原体污染4和跨文化污染*5可能是由于使用的吸管和其他设备。
- 对策
-
- 当执行实验,确保没有细菌从使用容器转移到使用吸管或其他外部设备。
- 将细胞尽可能少。
- * 4支原体污染:这指的是被支原体污染。这是最常见的一种现象,导致细胞污染。
- * 5跨文化污染:这指的是错误的混合其他细胞的细胞被观察到。最常见的是,其他细胞转移的设备。
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常见的活细胞成像失败示例2:细胞漂浮的焦点。
另一个常见的失败是发现焦点半道上实验的样品出去。这可能有几个原因:
原因1:温度漂移7导致细胞移动或设置改变。
如果你配置图像捕捉设置后立即打开设备,可能会把重点转移时配置设置。这是因为,对于一些长时间打开电源后,容器内的培养液是由对流循环,将细胞。失焦图像的另一个原因是,观察设备略扩张由于温度的变化。在悬浮细胞或贴壁细胞的观察,注意温度漂移的时候设置配置为图像实际上是捕获的时候。
- 对策
-
- 执行热身与空容器30分钟前将样品放置在设备。
- 将样品放置在设备后,等待一个额外的30到60分钟前设置你的焦平面。
- * 7温度漂移:这种现象在温度波动导致的悬浮细胞移动或设备本身的扩张取代获得焦点的位置。
原因2:细胞形态学的变化
活细胞上下移动(在Z方向)特别是在细胞分裂。结果,图像会模糊不清的如果您正在执行一次性图像获取即时的高倍镜下细胞分裂。
对策
- 使用一个低放大率和大景深镜头。*8
- 高的放大,使用自动对焦功能或Z-stack函数。
活细胞成像,可以准确地防止失败造成的形象的集中使用上面所示的预防方法。在这种情况下,关键是只设置自动对焦和Z-stack设定范围*9范围一样大必要的时间降到最低目标受到激发光。
- * 8景深:这表明区域内图像的焦点。一般来说,NA越大,浅景深。
- * 9 Z-stack设置范围:Z-stack是一个函数用于捕获数据的多个图像在不同Z-positions。你可以获得更多的信息在一个广阔的区域内通过捕获图像和高细节,但这也损害细胞通过一个匹配的数量,所以最好是图像捕获的数量尽可能少。
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常见的活细胞成像失败示例3:细胞离开视野。
有时当你查看一个实验数据后,你会看到细胞通过实验中途离开了视野。如果细胞移动的视场目标现象是完成之前,整个实验必须重复。
原因:细胞移动。
快门是保持开放的时间越长,机会越大,细胞将视野。只要细胞是活的,这个细胞运动不可避免。在各种各样的报纸,你可能看过数据显示细胞的具体条件。在许多情况下,这些数据是通过重复图像捕捉表现在高的放大,这就需要大量的时间和精力。
可靠地防止失败,最理想的方法是同时捕获多个位置的图像或跟踪移动的细胞在捕捉图像。
对策
- 获取广泛的视野较低的图像放大镜头。
- 同时捕获多个位置的图像。
你可以准确地捕捉他们通过观察的细胞而不丢失任何一个广泛的视野与低放大率。然而,很难观察到细胞与低放大的细节。更重要的是,注意,曝光时间越长,机会越大的图像变得模糊的目标在图像捕捉移动。*10
- * 10曝光时间和图像模糊:当你减少激发光的强度,曝光时间变得更长。如果细胞移动在快门打开,将模糊的图像。预防这个问题的有效的方法是使用一个相机与高灵敏度。
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显著改善活细胞成像实验效率
一般来说,取得更好的研究成果,它是必要的重复实验,以获得更多的信息。然而,活细胞成像,甚至一个实验需要大量的时间,所以重复实验需要大量的时间投资。理想情况下,一个单一的实验应该提供更多的信息。
日本基恩士的一体化荧光显微镜流线活细胞实验,获得最大的数据量。可以捕获数据在999位置,每个位置都有不同的捕捉设置,包括改变放大。BZ-X800系列是易于使用,即使新手用户可以快速建立大型实验。
